scholarpunk (scholarpunk) wrote in doktor_killer,
scholarpunk
scholarpunk
doktor_killer

Category:

Современное состояние исследований в области кровезаменителей с газотранспортной функцией

ВИЗГУ МНОГО, ТОЛКУ МАЛО!

Кислородопереносящие кровезаменители бывают двух типов – гемоглобиновые (на основе модифицированного гемоглобина) и перфторуглеродные (на основе эмульсии перфторуглеродов). Перфторуглеродные - на данном уровне развития науки путь тупиковый.
Применяемые в настоящее время в клинической практике как гемоглобиновые (а именно Hemopure®, PolyHeme® и отечественный «Геленпол»), так и перфторуглеродные («Флуозол» и «Перфторан») кровезаменители, имеют массу противопоказаний и побочных эффектов, а главное, ими можно заменять не более 30% ОЦК (объема циркулирующей крови). А при таких объемах кровопотерь вполне достаточно обыкновенных плазмозамещающих растворов.
Поэтому все виды существующих кровезаменителей нашли себе довольно узкую нишу – при заболеваниях и неотложных состояниях, характеризующихся сосудистым спазмом и резким нарушением микрокровотока. Там они могут оказывать максимальный эффект при применении даже в малом объеме. Малый размер молекул кровезаменителей позволяет обеспечивать свободную доставку кислорода к клеткам ишемизированных тканей через резко суженные капилляры (когда эритроциты попросту туда перестают помещаться).
Несмотря на обилие как научных работ, так и предлагаемых продуктов, мы вынуждены сделать вывод: пригодного к практическому использованию полноценного кровезаменителя с газотранспортной функцией реально НЕТ.
Из-за чего, собственно, все противопоказания и побочные эффекты:

  • Отсутствие антиоксидантных систем (систем борьбы с активными формами кислорода). Активные формы кислорода высокотоксичны сами по себе, а помимо этого еще и вызывают спазм сосудов, препятствуя доставке кислорода тканям. Собственные же антиоксидантные системы крови пациентов способны нейтрализовать активные формы кислорода только до определенного предела.

  • Отсутствие системы удаления CO2. В живых тканях (а тем более в эритроцитах) содер-жится достаточное количество фермента карбоангидразы (который этим и занимается), а вот в существующих искусственных и биосинтетических  внеклеточных субстратах ее наличия не предусматривается.

В первых кислородопереносящих кровезаменителях, (как на основе гемоглобина, так и эмульсии перфторуглеродов), проблемы с транспортом CO2 не учитывались. Однако при замене большей части крови кровезаменителем (например, при массивных кровопотерях) это смертельно опасно.
С середины 90-х годов XX века эти проблемы, однако, были осознаны. Были найдены пер-спективный дыхательный пигмент («внеклеточный гемоглобин») морских полихет, помимо кислородотранспортной обладающие супероксиддисмутазоподобными свойствами (частично способен бороться с активными формами кислорода). Начали разрабатываться «нанобиотехнологические растворимые комплексы» гемоглобина с каталазой, супероксиддисмутазой и карбоаргидразой, по своим газопереносящим свойствам превосходящие даже натуральную кровь.

Кровезаменители на основе перфторуглеродов

К перфторуглеродам относятся химически инертные вещества, в которых все атомы водорода замещены на атомы фтора. Фторуглероды не растворимы в воде, поэтому для того, чтобы сделать их пригодными для введения в кровеносное русло, из них готовят тонкодисперсные эмульсии с помощью поверхностно-активных веществ в качестве растворителя. В основе использования эмульсий лежит их способность растворять большие объемы кислорода и углекислого газа в сочетании с химической инертностью, что не представляет опасности для человека.
В отличие от гемоглобина, перфторуглероды не образуют с кислородом химических соединений, а растворяют его (как и другие газы) согласно закону Генри. Эта линейная связь, и степень растворения кислорода прямо пропорциональна его парциальному давлению (в отличие от S-образной кривой диссоциации оксигемоглобина). Перфторуглероды не метаболизируются в организме и считаются биологически инертными. Частицы внутривенно введенной их эмульсии быстро (в течение 4-12 часов) удаляются из сосудистого русла ретикуло-эндотелиальной системой, но могут аккумулироваться в паренхиматозных органах, частично экскретируясь  через дыхательные пути. Высок риск насыщения и блокады моноцитарно-макрофагальной системы в случае неоднократного использования.
История попыток применения перфторуглеродов как кровезаменителей ведет свое начало с экспериментов Кларков и Голлланом, в на 1960-х годов показавших возможность поддержания жизни мышей в жидкой перфторорганической среде. Впервые перфторуглеродный кровезаменитель был создан в середине 1960-х годов профессором Гейнером на основе 20% эмульсии перфторбутиламина. К сожалению, из-за избытка недофторированных аминов и свободных фторид-анионов  препарат оказался непригодным к практическому применению.
С тех пор все исследования велись в сторону очистки перфторуглеродов от  остаточных продуктов синтеза, и стабилизации эмульсий.
ПФУ обладают полифункциональным действием: улучшают газообмен и метаболизм на уровне тканей, повышают транспорт кислорода, обладают мембраностабилизирующим эффектом, улучшают кровоток и периферическую микроциркуляцию, восстанавливают центральную гемодинамику, обладают отчетливым кардиопротекторным действием, сорбционными и диуретическими свойствами. Кривая связывания кислорода имеет линейный характер. Отдача кислорода тканям больше у, чем у гемоглобина.
Хорошая оксигенация тканей обусловлена маленьким размером частиц эмульсии – всего 0,07 мкм (против размера эритроцита 7 мкм, что в 100 раз больше. Контактная поверхность ПФУ в среднем оказывается на порядок больше, чем у эритроциарной массы того же объема. ПФУ снижает активность симпатико-адреналовой и гистаминергической системы, повышая при этом активность антистрессорных систем (дофаминергической и серотонинергической), что ведет к нормализации общего периферического сосудистого сопротивления, стабилизации гемодинамики и антигипоксическому эффекту. Свое место ПФУ нашли и в трансплантологии, поскольку обеспечивают лучшее сохранение тканей, чем при обычной подготовке к трансплантации.
Условно перфторуглеродные кровезаменители можно разделить на три поколения:

I поколение

«Флуозол» (Green Cross Corporation Осака, Япония), созданный в 1979 году –  смесь перфтордекалина и перфтортрипропиламина (70:30) с использованием плуроника F-68 в качестве эмульгатора. Единственный из кислородопереносящих кровезаменителей, одобренный к медицинскому применению FDA. Аналогичные эмульсии разработаны в России – Перфторан (1984 г.)) и Китае (эмульсия №2).
В нашей стране исследования по созданию кровезаменителей на основе перфторуглеродных эмульсий (ПФУ) проводились с 1970-х годов в Ленинградском и Центральном НИИ гематологии и переливания крови, Институте теоретической и экспериментальной биофизики (ИТЭБ) АН СССР. К 1984 году в ИТЭБ был создан, а затем усовершенствован первый отечественный препарат нра основе смеси перфтордекалина и перфторметилциклогексилпиперидина, получивший название "Перфторан". В феврале 1996 года эмульсия Перфторан (фирма "Перфторан") зарегистрирована в РФ и разрешена для медицинского применения и промышленного выпуска.
Основные недостатки всех перфторуглеродных кровезаменителей I поколения – малая стабильность, технические трудности в подготовке к клиническому применению и такие побочные эффекты, как аллергические реакции и активация комплемента. Они также задерживаются в органах в течение продолжительного времени

II поколение

Препарат Oxygent (Альянс, Сан-Диего) на основе перфторктил бромида (перфлуброна), в качестве эмульгатора используют фосфолипиды яичного желтка, создавался в начале 2000-ных годов. Препарат имеет допустимо низкие значения давления пара и хорошую стабильность, а также проявляет устойчивость при стерилизации и замораживании. Недостатком является быстрое выведение моноцитарно-макрофагальной системой. Он относится к перфторуглеродам, которые имеют наиболее высокую растворимость кислорода.
К сожалению, в 2007 году третья стадия его клинических испытаний была отложена из-за большого количества инсультов.

III поколение

В настоящее время разрабатываются несколько раличных перфторуглеродных эмульсий, которые дополняются смешанными молекулярными фтороуглеродными, водородными основами в качестве стабилизатора концентрированных перфторуглеродных эмульсий, что обеспечивает лучший размер частиц. Однако никаких конкретных результатов пока нет.
На текущий момент в клинической практике используются только японский «Флуозол» и отечественный Перфторан.
Кровезаменители на основе гемоглобина

Попытки создания кислородопереносящих кровезаменителей на основе гемоглобина предпринимаются еще с 30-х годов прошлого века, когда была установлена способность гемоглобина сохранять свою структуру и функцию вне эритроцитов. Первые успешные попытки переливания были проведены W. Sellards, а в последствии лауреатом Нобелевской премии G. Minot в 1916 г. в Бостоне. 33 пациентам были введены небольшие объемы раствора свободного гемоглобина и отмечена хорошая переносимость.
Последующие попытки инфузии растворов свободного гемоглобина были безуспешными из-за множественных побочные эффектов: главным образом гипертензии и брадикардии. Это объясняется связыванием оскида азота (NO) с молекулами внеэритроцитарного гемоглобина (к которым тот имеет сродство гораздо большее, чем к  кислороду), свободно покидающего сосудистое русло сквозь эндотелий. Именно этим объясняется вазоконстрикция (в том числе кардио- и нефротоксичность) – от которых окончательно не избавлены все современные кровезаменители.
Свободный гемоглобин имеет гораздо большее сродство к кислороду, чем эритроцитарный (в эритроцитах его понижает 2,3-дифосфоглицерол). Другими недостатками свободного гемоглобина были малый период действия препарата и олигурия, из-за диссоциации молекул, а также быстрое окисление железа гема и интенсификация перекисного окисления липидов.
При разработке препаратов нового поколения в целях уменьшения вазоконстрикции и проявления прочих побочных эффектов (разрушение фильтров нефронов) стараются увеличивать размер кислородопереносящих молекул за счет полимеризации гемоглобина. Установлено, что эффекты вазконстрикции (проникновение молекул кровезаменителя через эндотелий и связывание ими NO) практически прекращается при достижении молекулы полигемоглобина молекулярной массы 320 кДа. Также полимеризация понижает степень сродства гемоглобина к кислороду, что позволяет в некоторых случаях приближать его к таковому цельной крови.
В качестве источника сырья используется человеческий (эритроцитарная масса с истекшим сроком годности) гемоглобин, и гемоглобин крупного рогатого скота (КРС). Гемоглобин КРС имеет  более низкое сродство к кислороду, чем человеческий. Другие экспериментальные препараты включают человеческий рекомбинантный гемоглобин, синтезируемый Е. coli, а также рекомбинантный гибрид человеческих α-субъединиц и коровьих β-субъединиц гемоглобина.
Полимеризуют гемоглобин главным образом при помощи глютаральдегида, реже диаспирина или О-раффинозы.
У полимеризованных гемоглобинов неожиданно обнаружились новые полезные свойства: устойчивость к окислению при хранении, способность повышать выделение эритроцитов из их депо при внутривенных инфузиях, стимуляция гемопоэза, а также более продолжительное время нахождения в сосудистом русле (более суток, в то время как свободный гемоглобин элиминируется из циркулирующей крови за нескольких часов, попутно норовя при этом загубить почки).
Все применяющиеся (или пытавшиеся применяться) кровезаменители на основе полигемоглобина довольно похожи друг на друга:
«Геленпол» — первый отечественный кислородпереносящий кровезаменитель на основе модифицированного полимеризованного гемоглобина, полученного из эритроцитов донорской крови. Представляет собой лиофильно высушенное полимерное производное гемоглобина для внутривенного введения с молекулярным весом 150–200 кДа. Препарат создан сотрудниками Российского НИИ гематологии и трансфузиологии МЗ РФ и НИИ высокомолекулярных соединений РАН. Обладает полифункциональным действием: помимо газотранспортной функции  также восстанавливает гемодинамику и стимулирует гемопоэз.
«Крунидон» – российский препарат НПК «Медбиофарм», в настоящее время проходящий клинические испытания. Как они называют его, «наноструктурный лекарственный препарат с кислородтранспортной функцией. Гемоглобин крупного рогатого скота, полимеризованный глютаральдегидом, молекулярный вес – 192–320 кДа.
ПАМ-3 –  российский препарат на основе полигемоглобина в лиофилизированной форме, созданный  Альянсом компетенций "ПАМ" на базе ГК "Медбиофарм", являющейся резидентом Сколково. Как заявляют разработчики,  «мировых аналогов, обладающих свойствами полигемоглобина, не существует», хотя обоснований не приводится.
Ближайшим аналогом является препарат Hemopure (OPK Biotech, США). Существенным конкурентным преимуществом препарата, как заявляют разработчики, «…является его высокая безопасность, которая обусловлена не только технологическими решениями, физико-химическими характеристиками препарата, его фармацевтической формой, но и, главным образом, научно-обоснованным предложением использовать более низкие концентрации (в 5-10 раз) препарата при сравнимой эффективности».
Препарат разрабатывается с 2014 года. В 2016 году завершена клиническая часть I фазы исследований.
PolyHeme (Northfield Laboratories, Evanston, IL, USA) получают из эритроцитарной массы с истёкшим сроком хранения, гемоглобин полимеризуют при помощи глутаральдегида, молекулярная масса 128–256 кДа. Применение препарата не сопровождается выраженными побочными эффектами, такими как вазоконстрикция и нефротоксичность. В декабре 2006 г. компания-производитель представила предварительные результаты второй стадии клинических исследований, свидетельствующие об увеличении летальности в группе получавших препарат.
НВОС-201, он же Hemopure, он же «Гемопюр», когда заявляется как отечественный (что отчасти правда, так как компания, собственно говоря, российская – ОПК «Биотех», она же Biopure, Cambridge. MA, USA). Представляет собой гемоглобин крупного рогатого скота, полимеризированный глутаральдегидом. Средний молекулярный  вес - 250 кДа. Побочные эффекты включают в себя вазоконстрикцию, повышение активности амилазы и липазы крови. Ограниченно используется в ЮАР, планируется к применению в России. Препарат Oxyglobin той же компании (отличается от Hemopure меньшей степенью очистки), в 80-е годы XX века применялся в ветеринарии.
Hemolink (Hemosol Research Corporation, Mississauga, Ontario, Canada) представляет собой полигемоглобин,  в котором О-раффинозой поперечно связаны β-цепи, стабилизируя тетрамеры, и соединены поверхностные аминокислоты. Использование препарата ограничено вследствие кардиотоксичности.
HemAssist (Baxter, Deerfield, IL, USA), полигемоглобин на основе поперечно сшитых диаспирином α-субъединиц. Первоначальные опыты на животных и клинические исследования с оценкой возможности применения в кардиохирургии показали значительное снижение потребности в препаратах крови. Однако пари испытаниях на догоспитальном этапе отмечена высокая летальность, и в настоящее время применение препарата приостановлено.
OxyVita (OXYVITA, Inc. New Windsor, New York, USA. Потрясающий воображение препарат на основе полимерного гемоглобина КРС, обладающий просто невообразимой молекулярной массой – 17 МДа. К сожалению, примерно с 2014 года, когда его собрались подавать на клинические испытания, о нем нет ровно никаких новостей. Мы предполагаем, что препятствием к его клиническому  применению могла явиться чрезмерная вязкость, связанная с большой массой молекул.
Кровезаменители на основе внеклеточного дыхательного пигмента
В первом десятилетии XXI века был разработан ряд препаратов на основе внеклеточного дыхательного пигмента морских полихет Arenicola marina, названого (М101). Из них правда, собственно кровезаменитель только один – HEMOXYCarrier®; остальные представляют из себя биодобавку к биотехнологическим средам (HEMOXCell®/ HEMUPStream®), аддитив для растворов консервации органов (HEMO2life®) и «оксигенирующий» перевязочный материал (HEMHealing®).
Этот дыхательный пигмент, в принципе, следует также относить к «гемоглобинам». Большинство ученых, работающих с беспозвоночными, чья кровь не имеет в своем составе клеточных элементов, а газотанспортной функцией обладает, так и называет их – «внеклеточные гемоглобины». Структура M101, однако, от гемоглобинов млекопитающих отличается кардинально. M101 уже сам по себе представляет собою аналог гемоглобиновго кровезаменителя II поколения: молекула пигмента имеет вес ∼3,600 кДа, более чем в 55 раз (!) превосходя гемоглобины млекопитающих, а также проявляет супероксиддисмутазоподобную активность, отчасти (чтобы полноценно - тут еще и каталаза нужна) предотвращающую появление потенциально опасных активных форм кислорода и свободных радикалов.
M101 представляет собой негликозилированный «гексагонально-двуслойный» (как показал рентгеноструктурный анализ) гемоглобин (hexagonal-bilayer Hb) (HBL-Hb)), состоящий из 156 глобинов и 44 неглобиновых линкерных цепей, обладает большой кислородосвязывающей способностью (до 156 молекул O2 при насыщении).
Сродство дыхательного пигмента к кислороду при физиологических увсловиях почти в четыре раза ниже, чем у цельной крови человека. Кривая связывания кислорода имеет линейный характер (что делает его похожим в этом на перфторуглеродные кровезаменители). В опытах на мышах  при попадании в кровоток не индуцировал иммуногенные и аллергенные реакции, не наблюдался также ни значимый вазоконстрикторный эффект, ни влияние на сердечный ритм.

Также 2017 году якобы планируется к испытаниям отечественный кровезаменитель на основа дыхательных пигментов морских червей, создаваемый для военных нужд, однако данные по этому проекту весьма скудны. А в нолвостях его периодически путают с ПАМ-3...
Кровезаменители на основе полигемоглобин-ферментных комплексов
Ни одна из существующих групп препаратов не совершенна, хотя на данный момент многие побочные эффекты гемоглобинов устранены за счет полимеризации молекул. Однако это не решает двух самых важных проблем.
Первая проблема – активные формы кислорода, которые высокотоксичны сами по себе, а помимо этого еще и вызывают спазм сосудов, препятствуя доставке кислорода тканям. Собственные же антиоксидантные системы крови пациентов способны нейтрализовать активные формы кислорода только до определенного предела.
Вторая нерешенная проблема – удаление CO2. В живых тканях (а тем более в эритроцитах) содержится достаточное количество карбоангидразы, а вот в существующих искусственных и биосинтетических  внеклеточных субстратах ее наличия не предусматривается.
В первых кислородопереносящих кровезаменителях, (как на основе модифицированного Hb, так и эмульсии перфторуглеродов), проблемы с транспортом CO2 не учитывались. Однако при замене большей части крови кровезаменителем (например, при массивных кровопотерях) это смертельно опасно. С середины 90-х годов XX века эти проблемы, однако, были осознаны. Были найдены перспективные дыхательные пигменты («внеклеточный гемоглобин») морских полихет, помимо кислородотранспортной обладающие супероксиддисмутазоподобными свойствами (см. выше). Одновременно с этим в канадском Университете МакГилл в научно-исследовательском центре  Искусственных Клеток и Органов научный коллектив под руководством профессора T. Ченга начал разработку комплексов полигемоглобина с различными ферментами:
2008 год – растворимый комплекс полигемоглобина супероксиддисмутазой и каталазой (polyHb-SOD-CAT) с антиоксидантной функцией.
2011 год – растворимый комплекс polyHb-SOD-CAT-CA с антиоксидантной и СО2-транспортной функцией. В 2013 году была показана способность кровезаменителя обеспечивать выживание крыс при замене  2/3 объема циркулирующей крови (модель геморрагического шока).
Потенциальными недостатками этих кровезаменитей могут являться вазоконстрикция и тромбообразование у пациентов в связи с отсутствием в его составе агентов, предотвращающих эти эффекты.
Параллельно с этим в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Воронежский государственный университет" (ГОУ ВПО ВГУ) в течение многих лет, как оказалось, занимался примерно тем же самым:
2011 год – полифункциональный полигемоглобин-ферментный комплекс, состоящий из молекул полигемоглобина различного состава, с молекулярной массой в диапазоне 300-3300 кДа (полимеризация глутаровым альдегидом). В отличие от упомянутых выше продуктов Университета МакГилл, обладает не только антиоксидантными, но также вазодилататорными и антитромбическими свойствами. Имеет оптимальные кислородтранспортные свойства и сроки функционирования в кровеносном русле, не повреждает почки, не вызывает агрегацию эритроцитов, не приводит к нарушению осмотического давления в сосудах. К сожалению, клинические испытания не проводились. Ограничились получением патента, кое-какими опытами на животных - и всё...
В последние двадцать лет (в немалой степени под влиянием профессора Cheng’а, являющегося, можно сказать, «законодателем моды» в этой области и занимающегося разработкой различного рода «искусственных клеток» уже более сорока лет) внимание исследователей сместилось в сторону разработки микрочастиц  «инкапсулированного гемоглобина» в различных гидрогелях и липосомах. Инкапсуляция потенциально способна увеличивать время выведения кровезаменителя из сосудистого русла, предотвращать проникновение сквозь эндотелий (в случае использования неполимеризованного гемоглобина), а также уменьшать реакцию со стороны иммунной системы. Однако, она не снимает требований к тому, что инкапсулировано, и потому никаких заслуживающих упоминания научных прорывов в этой области так и не случилось.

Заключение

Из-за неконтролируемого выделения активных форм кислорода объем их применения кислородотранспортных кровезаменителей в организме ограничивается мощностью собственных антиоксидантных систем крови, а in vitro вообще делает малопригодными даже при использовании антиоксидантов в составе культуральных сред. То же самое относится к транспорту CO2. Основное количество карбоангидразы находится в эритроцитах, так что излишнее «разбавление» крови ведет к быстрому истощению буферных систем и неконтролируемому ацидозу.
Применяемые в настоящее время в клинической практике как гемоглобиновые (а именно Hemopure®, PolyHeme® и отечественный «Геленпол»), так и перфторуглеродные («Флуозол» и «Перфторан») кровезаменители, имеют массу противопоказаний и побочных эффектов, а главное, ими можно заменять не более 30% ОЦК (объема циркулирующей крови).  А при таких объемах кровопотерь вполне достаточно обыкновенных плазмозамещающих растворов.
Поэтому все виды существующих кровезаменителей нашли себе довольно узкую клиническую нишу – при широком спектре заболеваний и неотложных состояний, характеризующихся сосудистым спазмом и резким нарушением микрокровотока. Там они могут оказывать максимальный эффект при применении даже в малом объеме. Малый размер молекул кровезаменителей позволяет обеспечивать свободную доставку кислорода к клеткам ишемизированных тканей через резко суженные капилляры.
К сожалению, в данной области, несмотря на обилие как научных работ, так и предлагаемых продуктов, вынужден сделать вывод: пригодного к практическому использованию полноценного кровезаменителя с газотранспортной функцией пока что не существует.

ВСЕ ПЛОХО!..

...
P. S. Отдельно следует отметить исследования аллостерических регуляторов обратимой оксигенации гемоглобина, которыми в восьмидесятые годы занимались представители  Института тонкой химической технологии им. И. В. Ломоносова (Москва) и Центрального научно-исследовательского института гематологии и переливания крови (Москва) – коллектив в составе А. Н. Чувилина, Г. А. Серебряковой, Г. А. Евстигнеева, Г. Н. Кольцова, Е. П. Вязова и Н. Я. Розенберга. Однако, в девяностых годах XX века эта область исследований заглохла в связи с проблемами с финансированием.
Tags: История Медицины
Subscribe

  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic

    Your IP address will be recorded 

  • 3 comments